1、引言
20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂多样的生物活性和功能，如多糖有免疫调节功能可作为广谱免疫促进剂，作为药物可以治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等；还具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂，促进核酸与蛋白质的生物合成等作用。菱，别名菱角、水菱角、风菱，为菱科菱属植物乌菱TrapabicomisOsbeck的种子，据文献记载，其果壳、果柄、果、茎及叶柄均可进药，有健胃止痢、抗癌等作用；还可用于治疗胃溃疡、痢疾、食道癌、子宫颈癌及乳腺癌等。
本研究首次从野生菱角壳中提取分离出多糖，并对多糖的单糖组成进行了深进的研究，为进一步开发和利用野生菱角资源提供了科学依据。
2、实验部分
2.1 样品、试剂与仪器市售的菱角往仁后，壳晒干，粉碎备用。单糖及双糖标准物质(半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖和蜜二糖)均购自ChemService，纯度大于98％。所用化学试剂除甲醇和乙醇为色谱纯外，其余均为分析纯。UV-2501PC紫外光谱仪(日本岛津公司)；NicoletMagna560傅里叶变换红外光谱仪(美国尼高力公司)；VarianUnityPlus600核磁共振波谱仪(美国瓦里安公司)；HP6890和HP5973气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)。
2.2 实验方法
(1)多糖化合物的提取及纯化方法称取800g洗净晒干的菱角壳，加人1:1乙醇-乙醚混合液，65℃水浴回流1～3h往脂；残渣中加水，9O～100℃水浴提取4～6h，更换净水反复提取2～3次，合并深红色多糖提取液，过滤，浓缩。向提取液加人3／7倍体积的乙醇，离心分离沉淀，冻干得多糖粗品F1。向上清液中加人1.0倍体积的乙醇，离心分离沉淀，冻干得多糖粗品F2。依此方法，向上清液中先后加人1.5和4.0倍体积乙醇，分别得到多糖粗品F3和F4。。若直接向原多糖提取液中加人4倍体积的无水乙醇，则得到混合多糖粗品F5。用Sevag法除往多糖粗品中的蛋白质，H2O2法除往色素，透析72h后，浓缩，冻干，即得多糖纯品；
(2)多糖的水解取多糖样品10mg于安瓶中加人3moL／L三氟乙酸2mL，密封后在120℃恒温中水解6h，用氮气吹干三氟乙酸，加甲醇并吹干，水解产物加进0.6mL0.05mol／LNaOH溶液，再加5mgNaBH4，室温下反应8—10h，加少许乙酸分解过量的NaBH4，至无气泡产生为止。蒸干反应液，以酸性甲醇洗涤反应产物，蒸干甲醇液，重复3—4次以除往硼酸根，最后加进甲醇蒸干并于烘箱中105℃除净水分；
(3)乙酰化衍生法取水解得的单糖3mg，加进0.5mL吡啶，1mL乙酸酐，加热2h，冷却后加甲苯2mL，用N2吹干，加进氯仿，蒸馏水洗涤，用N2吹干得到棕黄色产物。此乙酰化的单糖醇用CHC13稀释后进行气相色谱-质谱分析；(4)三甲基硅烷化衍生法取水解得的单糖样品6mg，加吡啶0.6mL，六甲基四硅胺烷0.2mL，三甲基氯硅烷0.2mL，振荡，静置，取上清液进行气相色谱-质谱分析。
2.3 GC-MS分析条件HP-5石英毛细管色谱柱(美国安捷伦公司)，(50m×0.22mmi。d。，0.25μm)；EI源，电子能量70eV，分子量扫描范围33—550，进样口温度260℃，接口温度270℃，载气氦气流速1.2mL／min，分流比20：1， 程序升温：100℃→1O℃／min150℃→15℃/min260℃(40min).
3、结果与讨论
3.1 菱角壳提取物中多糖的鉴定分析Molisch实验：硫酸和多糖溶液分为两层，层与层之间有紫色环出现。说明提取物确含糖。混合多糖F5纯品的FT-IR谱图。谱图中多处可见到多糖的特征峰，如：3435/cm，2924/cm的吸收峰分别为O—H，C—H的伸缩振动峰，1193/cm，1037/cm处的吸收峰是多糖中C—O，C—O—C伸缩振动和C—OH的弯曲振动特征峰，在1000—700/cm的吸收峰则是α-和β-吡喃单糖形成的特征。
混合多糖F5纯品的HNMR谱图。谱图中δ3.5—δ5.5之间可见多个糖质子的响应信号峰，其中δ4.605、δ4.7和δ4.9223个峰是β-吡喃环上的质子信号，而δ5.238、δ5.348、δ5.446、δ5.465和δ5.515则可能来自于α-吡喃环上的质子，由此可见，此多糖可能是由多种单糖组成。
3.2 菱角壳多糖中单糖组成的确定样品F1一F4水解产物的乙酰化衍生物经气相色谱-质谱分析，通过与标准色谱图对照比较和质谱碎片解析，确定了其单糖组成及摩尔比。数据表明，4种多糖分别由不同摩尔比的几种单糖(如阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖)和二糖(乳糖、蜜二糖)组成，其中多糖F2一F4的单糖组成相同，只是摩尔比略有不同；而F1则由5种单糖和2种二糖组成。葡萄糖，半乳糖和甘露糖在4种多糖中占的比例较大，是菱角多糖的主要成分。
混合多糖样品F5的甲基硅烷化衍生物的GC-MS，经碎片分析并利用标准质谱NIST库进行检索，l1个色谱峰被确以为单糖的甲基硅烷化衍生物。由于在衍生化过程中α型和β型吡喃和呋喃异构体的天生，同一单糖可以天生几种衍生物。因此，只检出5种单糖，其中包括两种戊糖(阿拉伯糖和木糖)，3种己糖(甘露糖，半乳糖和葡萄糖)。从峰面积百分比数据还可以看出，葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖在该混合多糖中所占的比例较大，是菱角多糖的主要成分，这与乙酰化分析的结果基本一致。
