微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映.因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标,同时,微生物在生产实践上的各种应用或是对致病,霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关.所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法.既然生长意味着原生质含量的增加,所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据,而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上.微生物生长的衡量,可以从其重量,体积,密度,浓度,做指标来进行衡量.
一、生长量测定法
1、体积测量法:又称测菌丝浓度法.
通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况.方法是,取一定量的待测培养液(如 10毫升)放在有刻度的离心管中,设定一定的离心时间(如5分钟)和转速(如5000 rpm),离心后,倒出上清夜,测出上清夜体积为v,则菌丝浓度为(10-v)/10.菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标.这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设定一致的处理条件,否则偏差很大,由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物,结果会有一定偏差.
2、称干重法:
可用离心或过滤法测定.一般干重为湿重的10-20%.在离心法中,将一定体积待测培养液倒入离心管中,设定一定的离心时间和转速,进行离心,并用清水离心洗涤1-5次,进行干燥.干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干,或采用红外线烘干,也可在80℃或40℃下真空干燥,干燥后称重.如用过滤法,丝状真菌可用滤纸过滤,细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤,过滤后用少量水洗涤,在40℃下进行真空干燥.称干重发法较为烦琐,通常获取的微生物产品为菌体时,常采用这种方法,如活性干酵母(activity dry yeast, ADY),一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料.
3、比浊法:
微生物的生长引起培养物混浊度的增高.通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值,判断微生物的生长状况.对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时,可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶.将侧臂插入光电比色计的比色座孔中,即可随时测定其生长情况,而不必取菌液.该法主要用于发酵工业菌体生长监测.如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计,在波长600nm 处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600,以此监控E.Coli的生长及诱导时间.
4、菌丝长度测量法:
对于丝状真菌和一些放线菌,可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度,或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管,到入合适的培养基,卧放,在开口的一端接种微生物,一段时间后记录其菌丝生长长度,借此衡量丝状微生物的生长.
二、微生物计数法
1、血球计数板法:
血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片,玻片上有四条沟和两条嵴,中央有一短横沟和两个平台,两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm,每个平台上刻有不同规格的格网,中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格.通过油镜观察,统计一定大格内微生物的数量,即可算出1毫升菌液中所含的菌体数.这种方法简便,直观,快捷,但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数,并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数.
2、染色计数法:
为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数,而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足,人们发明了染色计数法.借助不同的染料对菌体进行适当的染色,可以更方便的在显微镜下进行活菌计数.如酵母活细胞计数可用美蓝染色液,染色后在显微镜下观察,活细胞为无色,而死细胞为蓝色.
3、比例计数法:
将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合,在显微镜视野中数出各自的数目,即可得未知菌液的细胞浓度.这种计数方法比较粗放.并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准.
4、液体稀释法:
对未知菌样做连续十倍系列稀释,根据估计数,从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样,接种1毫升到3组共 15只装培养液的试管中,经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数,然后查最大或然数表MPN(most probably number)得出菌样的含菌数,根据样品稀释倍数计算出活菌含量.该法常用于食品中微生物的检测,例如饮用水和牛奶的微生物限量检查.
5、平板菌落计数法:
这是一种最常用的活菌计数法.将待测菌液进行梯度稀释,取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合,或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上.保温培养后,用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度,即可算出原菌液的含菌数.一般以直径9cm的平板上出现 50-500个菌落为宜.但方法比较麻烦,操作者需有熟练的技术.平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数,而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养,获得了单克隆.
6、试剂纸法:
在平板计数法的基础上,发展了小型商品化产品以供快速计数用.形式有小型厚滤纸片,琼脂片等.在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基,其中加入活性指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,无色)待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养.短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量.试剂纸法计数快捷准确,相比而言避免了平板计数法的人为操作误差.
7、膜过滤法:
用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品,经丫叮橙染色,在紫外显微镜下观察细胞的荧光,活细胞会发橙色荧光,而死细胞则发绿色荧光.
8、生理指标法:
微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化,例如酸碱度,发酵液中的含氮量,含糖量,产气量等,与生长量相平行的生理指标很多,它们可作为生长测定的相对值.
9、测定含氮量:
大多数细菌的含氮量为干重的12.5%,酵母为7.5%,霉菌为6.0%.根据含氮量×6.25,即可测定粗蛋白的含量.含氮量的测定方法有很多,如用硫酸,过氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas测N2气法.Dumas测N2气法是将样品与CuO混合,在CO2气流中加热后产生氮气,收集在呼吸计中,用KOH吸去CO2后即可测出N2的量.
10、测定含碳量:
将少量(干重0.2-2.0 mg)生物材料混入1毫升水或无机缓冲液中,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加热30分钟后冷却.加水稀释至5毫升,在580nm的波长下读取吸光光度值,即可推算出生长量.需用试剂做空白对照,用标准样品做标准曲线.
11、还原糖测定法:
还原糖通常是指单糖或寡糖,可以被微生物直接利用,通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况,常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测.方法是,离心发酵液,取上清液,加入斐林试剂,沸水浴煮沸3分钟,取出加少许盐酸酸化,加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液,继续加Na2S2O3至终点,查表读出还原糖的含量.
12、氨基氮的测定:
方法是:离心发酵液,取上清液,加入甲基红和盐酸作指示剂,加入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去,加入底物18%的中性甲醛,反应数刻,加入0.02N的使之变色,根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量.根据培养液中氨基氮的含量,可间接反映微生物的生长状况.
13、其他生理物质的测定:
P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸,产气,产CO2(用标记葡萄糖做基质),耗氧,黏度,产热等指标,都可用于生长量的测定.也可以根据反应前后的基质浓度变化,最终产气量,微生物活性三方面的测定反映微生物的生长.如我所在BMP-2的发酵生产上,随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化,判断细菌的长势.
三、商业化微生物快速检测法
微生物的检测,其发展方向是快速,准确,简便,自动化,当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理,结合不同的检测方法,设计了形式各异的微生物检测仪器设备,正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域.
1、抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术结合解决了传统微生物检测手段不能解决的难题,为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础.中科院广州分院合作产业处提供的抗干扰微生物培养基,新型生化鉴定管,微生物计数卡,环境质量检测试剂盒等,可方便的用于多项检测.
2、BACTOMETER 全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果,样本颜色及光学特征都不影响读数,对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法(IMPEDANCE TECHNOLOGY)将待测样本与培养基置于反应试剂盒内,底部有一对不锈钢电极,测定因微生物生长而产生阻抗改变.如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子,电阻抗法可测试这种微弱变化,从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量.测定项目包括总生菌数,酵母菌,大肠杆菌群,霉菌,乳酸菌,嗜热菌,革兰氏阴性菌,金黄色葡萄球菌等.
这些仪器和设备的生产厂家很多,产品各异,在此不做一一介绍,具体可查看各公司的产品说明.
