目的：学习从土壤中分离微生物的方法,学习无菌操作技术.
内容：
1．用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌.
2．用平板划线方法分离微生物.
3．学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术.
二、材料和用具
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通变形菌(Proteus vulgaris)斜面菌种.
牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶,49.5mL无菌水(带玻璃珠)1瓶,4.5mL无菌水6管,80%乳酸,10%酚液,95%乙醇.
无菌培养皿12套,1mL无菌移液管10支,土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮.
三、操作步骤
(一)土壤稀释分离：
1、取土壤：取表层以下5—10cm处的土样,放入无菌的袋中备用,或放在4℃冰箱中暂存.
2、制备稀释液(要无菌操作)
(1)制备土壤悬液：
称土样0.5g,迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好),振荡5～10min,使土样充分打散,即成为10-2的土壤悬液.
(2)稀释：
用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL,放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液,如此重复,可依次制成10-3～10-8的稀释液(图 3-1).注意：操作时管尖不能接触液面,每一个稀释度换用一支移液管,每次吸入土液后,要将移液管插入液面,吹吸3次,每次吸上的液面要高于前一次,以 减少稀释中的误差.
3、混菌法测定菌落数的方法
(1)细菌：取10-7、10-6两管稀释液各1mL,分别接人相应标号的平皿中,每个稀释度接两个平皿.然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基,分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜),迅速轻轻摇动平皿,使菌液与培 养基充分混匀,但不沾湿皿的边缘,待琼脂凝固即成细菌平板.倒平板时要注意无菌操作.
(2)放线菌：取10-5、10-4两管稀释液,在每管中加入10%酚液5～6滴,摇匀,静置片刻,然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中,选用高氏1号培养基,用与细菌相同的方法倒入平皿中,便可制成放线菌平板.
(3)霉菌：取10-2、10-3两管稀释各1mL,分别接入相应标号的平皿中,每个稀释度接两个平皿.在融化的土豆蔗糖培养基中,每100mL加入灭菌的乳酸1mL,轻轻摇匀,然后用与细菌相同的方法倒入平皿中,便可制成霉菌的平板.
4、培养：将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置,即皿盖朝下放置,于28～30℃中恒温培养,细菌培养1～2d,放线菌培养5～7d,霉菌培养3～5d.观察生长的菌落,用于进一步纯化分离或直接转接斜面.
(二)平板制作及划线分离方法：
1．倒平板：按无菌操作要求,在火焰旁操作,做法如3(1).
2．划线分离：使用接种环,从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样,在相应培养基平板中划线分离,划线的方法多样,目的是获得单个菌落,.
(三)斜面接种和穿刺接种：
1．斜面接种
(1)取新鲜固体斜面培养基,分别做好标记(写上菌名、接种日期、接种人等),然后用无菌操作方法,把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上.
(2)接种的方法是,用接种环沾取少量待接菌种,然后在新鲜斜面上“之”字形划线,方向是从下部开始,一直划至上部(图3—4A).注意划线要轻,不可把培养基划破.
(3)接种后30℃ 恒温培养,细菌培养48h,放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存.
2．穿刺接种
(1)取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基,做好标记(写上菌名)、接种日期,接种人等).
(2)接种的方法是,用接种针沾取少量待接菌种,然后从柱状培养基的中心穿入其底部(但不要穿透),然后沿原刺入路线抽出接种针,注意接种针不要移动.
(3)接种后30℃恒温培养, 24h后观察,比较两种菌的生长结果.
四、注意事项
1．一般土壤中,细菌最多,放线菌及霉菌次之,而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中,故从土壤中分离细菌时,要取较高的稀释度,否则菌落连成一片不能计数.
2．在土壤稀释分离操作中,每稀释10倍,最好更换一次移液管,使计数准确.
3．放线菌的培养时间较长,故制平板的培养基用量可适当增多.
五、实验结果
记录土壤稀释分离结果,并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量.
计算方法：选择长出菌落数30～300之间的培养皿进行计数,按以下公式：
总菌数/g=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数
