一、实验目的和内容:
目的:
以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例,学习微生物诱变育种的基本操作方法.
内容:
1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理,制备孢子悬液.
2．用紫外线进行诱变处理.
3．用平板透明圈法进行两次初筛.
4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定.
二、实验材料和用具:
米曲霉斜面菌种；
豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白；
三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯.
三、操作步骤:
(一)出发菌株的选择及菌悬液制备:
1、出发菌株的选择:
可直接选用生产酱油的米曲霉菌株,或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株.
2、菌悬液制备:
取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中,30℃培养3～5d 活化.然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠,装量以大致铺满瓶底为宜),30℃振荡30min,用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤,制成把子悬液,调其浓度为106～108 个/mL,冷冻保藏备用.
(二)诱变处理:
用物理方法或化学方法,所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定,有时还可采用复合处理,可获得更好的结果.本实验学习用紫外线照射的诱变方法.
1、紫外线处理:
打开紫外灯(30W)预热20min.取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中,同时制作5 份.逐一操作,将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上,照射l min 后打开培养皿盖,开始照射,与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌,即时计算时间,照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min.照射后,诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛.
2、稀释菌悬液:
按10 倍稀释至10-6,从10-5 和10-6 中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复),然后涂菌并静置,待菌液渗入培养基后倒置,于30℃恒温培养2～3d.
(三)优良菌株的筛选:
1、初筛:
首先观察在菌落周围出现的透明圈大小,并测量其菌落直径与透明圈直径之比,选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个,作为复筛菌株.
2、平板复筛:
分别倒酪素培养基平板,在每个平皿的背面用红笔划线分区,从圆心划线至周边分成8 等份,1～7 份中点种初筛菌株,第8 份点种原始菌株,作为对照.培养48h 后即可见生长,若出现明显的透明圈,即可按初筛方法检测,获得数株二次优良菌株,进大摇瓶复筛阶段.
3、摇瓶复筛:
将初筛出的菌株,接入米曲霉复筛培养基中进行培养,其方法是,称取麦秩85g,豆饼粉(或面粉)15g,加水95～110mL(称为润水),水含量以手捏后指缝有水而不下滴为宜,于500mL 三角瓶中装入15～20g(料厚为1～1.5cm),121℃湿热灭菌30min,然后分别接入以上初筛获得的优良菌株,30℃培养,24h 后摇瓶一次并均匀铺开,再培养24～48h,共培养3～5d 后检测蛋白酶活性.
4、蛋白酶的测定方法:
(1)取样:培养后随机称取以上摇瓶培养物1g,加蒸馏水100mL,(或200mL),40℃水浴,浸酶1h,取上清浸液测定酶活性.另取lg 培养物于105℃烘干测定含水量.
(2)酶活性测定:30℃ pH7.5 条件下水解酪蛋白(底物为0.5%酪蛋白),每分钟产酪氨酸1μg 为一个酶活力单位.计算公式为:
(A 样品OD680nm 值-A 对照OD680nm 值)×K×V/t×N
K:标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数；
V:酶促反应的总体积；
t: 酶促反应时间(min)；
N:酶的稀释倍数.
5:谷氨酸的检测:
此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一.
检测培养基:豆饼粉:麸夫=6:4,润水75%,121℃湿热灭菌30min.
谷氨酸测定:于以上培养基中加入7%盐水(W/V),40～45℃水浴,水解9d 后过滤,以滤液检测谷氨酸含量(测压法).
四、注意事项:
1、紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤.
2、诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行,并在黑暗中培养.
五、实验报告:
1、试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果.
2、你认为以上的筛选方法有什么优缺点,如何改进？
六、问题和思考:
1、试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题.
2、为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？
注:筛选菌株数的计算 若按突变率为0.01 计算,则一次筛选可取250—300 个菌落,
第一次筛选后可多选几株高产株,而二级筛选为重点阶段,其最适量可参考以下计算方法:如初筛菌株数为200 株,二次筛选欲选株数为2 株,则二级应选(200×2)1/2,为20 株,这样的数量选择,使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株.