革兰染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：涂片固定；草酸铵结晶紫染1 min，自来水冲洗；加碘液覆盖涂面染1 min；水洗，用吸水纸吸去水分；加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30 S后水洗，吸去水分；复红染色液(稀)染30 S后，自来水冲洗。干燥，镜检。染色的结果，革兰正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。但在我们的实际染色结果中，特别是同学在初学时往往会出现一些错误使染色结果与实际结果不一致。通过多年的教学实践，我们总结出可能是以下几方面的因素的影响。
1 操作因素
1.1 涂片太厚 在涂片时细菌挑的太多，没法分开，在脱色时就不能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去，可能会使革兰阴性菌也出现紫色，误认为革兰阳性菌。
1.2 脱色时间 阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色；但这是在固定的时间条件下的结果，如果延长脱色时间，也会使脱色剂渗透进阳性菌的细胞壁中，使染上的结晶紫脱去颜色，最后染上复红的颜色，变成革兰阴性菌。而脱色时间太短的话又会使阴性菌染上的结晶紫不能完全脱色，出现紫色，误认为革兰阳性菌。
1.3 固定方法 固定不仅能杀死细菌，改变细菌对染料的通透性，还能使细菌吸附在玻片上，保持原有的形态结构。固定方法是将干燥后的细菌涂片以中等速度通过火焰三次，以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜。但在实际操作中有的同学将玻片在火焰上烤的太久，改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生变化。影响了染色的结果。
2 细菌因素
2.1 细菌培养时间 细菌的典型形态、染色性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰染色可以反应细菌的真实的染色性。如果细菌培养时间太长，变成了老龄菌，染色性就会发生变化，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
2.2 培养基的成分 一般认为革兰阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色。但是如果培养基中缺乏核蛋白质镁盐就不能合成菌体成分的核蛋白质镁盐，细菌与碘和结晶紫的复合物结合就不牢固，容易脱色，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
3 染液因素
3.1 碘液 碘液作为媒染剂能增加染料与被染物的亲和力。如果碘液放置时间太长，或经日光照射失效，失去媒染剂的作用，就可能使结晶紫与细菌结合的不牢固，容易被脱色，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
3.2 结晶紫 结晶紫的浓度太高，就会使染上的颜色不容易被酒精脱色，可能会使革兰阴性菌染成革兰阳性菌。
3.3 酒精 酒精作为脱色剂，革兰染色的脱色酒精浓度为95% ，在此浓度下革兰阳性菌染上的结晶紫不易被脱去，保留紫色，革兰阴性菌染上的结晶紫容易被脱去，最后呈红色。但当酒精的浓度为70% 时，它的脱色能力最强，可能使革兰阳性菌染上的结晶紫也被脱去，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
综上所述，影响染色的其他因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。此外，培养基的组成、菌龄、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染色，所以我们在染色时要注意当染色结果与预想的结果出现不一致时，要考虑到这些因素的影响。对同学来讲重点强调操作因素的影响，使他们在一开始学习革兰染色，就认真对待，养成良好的学习态度，严格按照操作规程来做，提高实验结果的准确性。