一、用途
弯曲杆菌乳胶凝集快速检测试剂用于快速确证鉴定细菌性肠炎病人的粪便样品在选择性平板上分离出的可疑肠道致病性的嗜温性弯曲杆菌菌落。该试剂盒仅供专业人员使用。
二、原理
乳胶颗粒表面包被有与空肠弯曲杆菌血清型抗原具有特异性的兔免疫球蛋白，当敏化的乳胶颗粒遇到弯曲杆菌致病菌的抗原时，可发生特异性、高灵敏度的免疫化学反应，使分散的乳胶微粒迅速形成肉眼可见的凝集。
三、试剂盒组成成分
REAG TEST 测试试剂 M
乳胶颗粒包被与弯曲杆菌抗原具有特异性的兔抗体。含0.099%的叠氮化钠防腐剂。（蓝色瓶盖）
REAG CONTROL 对照试剂 M46b 阴性对照乳胶试剂 2.5mL
乳胶颗粒包被有非特异性的兔免疫球蛋白，含0.099%的叠氮化钠防腐剂。（白色瓶盖）
CONTROL + 阳性对照试剂 M
不具活性的弯曲杆菌抗原，与测试乳胶试剂反应，但不与对照乳胶试剂反应。含0.099%的叠氮化钠防腐剂。（黑色瓶盖）
SAMP DIL 样品稀释液 M46d 样品稀释液 50mL
甘氨酸缓冲盐水，含0.099%的叠氮化钠防腐剂。
使用说明书
检测板
搅拌棒
需要的其它材料
l 接种环
l 弯曲杆菌选择性平板
l 塑料样品试管（容积1mL）
l 维持微需氧环境的气罐
l
四、警告和注意事项
安全：
1、试剂仅供体外诊断使用
2、试剂盒作防腐剂使用的叠氮化钠可与铅或铜制品反应形成易爆的金属叠氮化物。可用大量水冲洗以避免叠氮化物的堆积。
3、在处理或检测可疑致病菌时应采取适当的预防措施。被污染的物品可用3%的次氯酸钠消毒处理30分钟。含酸的废液应作中和处理。
4、阳性对照液在生产中已作惰性处理。但在使用中，依然应遵循潜在传染性产品的处理程序。
检测过程：
1、试剂盒应按说明书使用。
2、所有试剂在使用前应达到室温。
3、不要稀释试剂盒内的任何试剂。
4、不要混合不同批次试剂盒的试剂。
5、不要冷冻试剂盒内的试剂。
6、不要使检测乳胶试剂的滴管接触到阳性对照试剂或细菌样品。
7、使用前应确保检测板清洁干燥。
五、贮存及保质期
检测试剂盒不使用时应贮存在2～8℃，并应在包装盒标签上的有效期内使用检测试剂。
六、样本
粪便样品应先在无血的选择性培养基上培养（改良CCDA Preston培养基）(见附录)，每个平板接种0.2～0.3克的样品，平板应在微氧环境中42℃培养48小时。
用乳胶凝集试剂检测选择性分离平板上的可疑弯曲杆菌菌落。
七、检测过程
质量控制：
在每次使用检测试剂盒前应用阳性对照作下列质量控制检测，以确保试剂有效。
1、分别滴1滴50μL阳性对照于检测板的2个相邻反应环内。
2、然后分别用测试液和对照液按以下“测试程序”进行检测。
3、如果出现下列情况，试剂可能出现变质：
l 阳性对照与测试试剂无反应或反应的强度随时间减弱。
l 阴性对照试剂与阳性对照发生反应。
l 测试试剂变成无色或结块并无法摇成均匀悬浮液。
测试程序：
1、待所有试剂达到室温时，将测试乳胶试剂轻轻地摇成均匀的悬浮液。
2、分别滴加50μL的稀释样品液于检测板的2个反应环内
3、分别用接种环挑取几个可疑的弯曲杆菌菌落与反应环内的稀释样品液混合，形成均匀的菌悬液。如果平板上的菌落较稀小，应在平板表面挑取更多的菌落。
4、于1个反应环内的菌悬液中滴1滴（50μL）阴性对照试剂，同样的于另1个反应环内的菌悬液中滴1滴（50μL）乳胶测试试剂。
5、用1支搅拌棒在整个反应环内混匀阴性对照试剂和菌悬液，然后再混匀测试试剂和菌悬液。
6、轻摇检测板，使混匀液在反应环内轻轻流动2分钟，观察凝集结果。
7、按下表判断结果。
8、记录结果后，将搅拌棒和检测板进行适当的消毒处理。
八、结果说明
凝集反应出现肉眼可见的乳胶颗粒聚集，其反应强度会有所不同，可依据下列原则判断：
＋ 凝集颗粒较细，但易于辨别，背景为乳状。
＋＋颗粒较粗，背景为乳状。
＋＋＋显著的凝集聚集于椭圆形反应环的内边缘，背景清晰。
弯曲杆菌乳胶凝集试剂盒的结果，说明如下：
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与测试试剂反应 |
与阴性对照试剂反应 |
结果判断 |
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＋ |
－ |
存在弯曲杆菌 |
|
－ |
－ |
如测试时可疑菌量足够，则不存在弯曲杆菌 |
|
＋ |
＋ |
非特异性凝集，结果不确定 |
如果样品引起质量控制试剂凝集，即不可用乳胶试剂盒检测。
九、使用的局限性
1、结果应依据所有的临床和实验室信息进行判断。
2、非特异性凝集不排除存在弯曲杆菌的可能性，只是结果不确定。样品应采用其它方法检测。
3、弯曲杆菌数量过低时，可导致阴性结果。应检测48小时的培养物，以使其数量达到最大值。
十、检测效果对比
分别在两个独立的检测中心和公司内部对Microscreen弯曲杆菌乳胶试剂盒确证检测效果进行评价。527份粪便样品经选择性平板上接种培养48小时，用Microscreen弯曲杆菌乳胶试剂盒测试其菌落。
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Microscreen |
总计 |
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阳性 |
阴性 |
|||
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参考方法 |
阳性 |
143 |
2 |
145 |
|
阴性 |
1 |
381 |
382 |
|
|
总计 |
144 |
383 |
527 |
|
灵敏度：143/145=98.6%
特异性：381/382=99.7%
有效性：524/527=99.4%
通过测试以下大量不同的菌株的培养物来验证Microscreen弯曲杆菌乳胶试剂盒的特异性：
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菌株 |
菌落数量 |
Microscreen弯曲杆菌乳胶试剂盒 |
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阳性 |
阴性 |
非特异反应 |
||
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嗜温性弯曲杆菌 空肠弯曲杆菌 C.jejuni subsp. Doylei C. coli C. upsaliensis C. laridis 胎儿弯曲杆菌 |
37 3 4 13 1 2 |
37 3 4 13 1 2 |
0 0 0 0 0 0 |
0 0 0 0 0 0 |
|
非嗜温性弯曲杆菌 C. concisus C. hyointestinalis C. sputorum faecalis C. curvis |
5 3 1 2 |
0 0 0 0 |
3 3 0 2 |
2(弱) 0 1(弱) 0 |
|
近近相关联的细菌 Helicobacter pylori Helicobacter fennelliae Helicobacter cinaedi Arcobacter butzleri Arcobacter skirrowii |
12 5 4 4 1 |
2(弱) 0 2 0 0 |
10 5 2 4 1 |
0 0 0 0 0 |
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其它无关联细菌 斯氏普罗威登斯菌 产碱普罗威登斯菌 大肠杆菌 铜绿假单胞菌 柠檬酸杆菌 弗氏柠檬酸杆菌 α链球菌 β链球菌 肺炎克雷伯氏菌 爱氏克雷伯氏菌 奇异变形杆菌 普通变形杆菌 沙门氏菌 沙门氏菌(B群) 沙门氏菌(C群) 福氏志贺氏菌 痢疾志贺氏菌 宋内志贺氏菌 嗜水气单孢菌 金黄色葡萄球菌 草生欧文氏菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 艰难梭菌 弧菌 霍乱弧菌 副溶血性弧菌 蜂房哈夫尼菌 不动杆菌 鲍氏不动杆菌 酵母 |
1 1 5 2 9 1 2 1 1 1 2 3 11 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1 1 1 1 1 |
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |
1 1 5 2 9 1 2 1 1 1 2 3 11 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1 1 1 0 1 |
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1(强) 0 |
所有测试的嗜温弯曲杆菌均与Microscreen弯曲杆菌乳胶试剂反应。测试的11株非嗜温性的弯曲杆菌中，3株呈现出微弱的非特异性凝集，其余的均不与乳胶试剂反应。
在相近的有关联的细菌组中，2株Helicobacter pylori(共有12株)在测试中呈现微弱反应，2株Helicobater cinaedi 出现交叉反应。
测试了大范围的其它无关联的细菌，除了1株鲍氏不动杆菌呈现出较强的非特异性凝集外，其余均不与乳胶试剂反应。
十一、重复性
批内重复性：通过以系列稀释度的参照抗原和试剂盒对照抗原对同1批产品的灵敏度进行检测。由不同的操作者随机测试3次，最终效价由参照/对照抗原测定，并且3次定性分析结果完全一致。
批间的重复性：通过以系列稀释度的参照抗原和试剂盒对照抗原对3批产品的灵敏度进行检测。3个批次间，最终效价无显著差异。
附录
准备无血选择性培养基—改良CCDA Preston.
1、 称取22.75g弯曲杆菌无血选择性基础培养基(Campylobacter Blood-Free Selective Agar Base (Oxoid CM739))，溶于500mL蒸馏水中，煮沸溶解。
2、
3、培养基冷却至50℃，无菌条件添加1支氨哌羟苯唑头孢菌素选择性添加剂(Cefoperazone Selective Supplement (Oxoid SR125))。
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